Centrifugación mediante un gradiente de densidades

Centrifugacion mediante un gradiente de densidaades

¿Qué es la centrifugación mediante un gradiente de densidades?

La centrifugación mediante un gradiente de densidades es un sistema donde se separan las partículas en función de su densidad de flotación. Para ello, la muestra se mezcla en un medio con un gradiente de densidad más pronunciado o se pone por encima de éste;  siendo la base un perfil incremental  de sustancias como: sacarosa, cloruro de cesio, u otros. Al centrifugar, cada componente subcelular se desplaza en forma ascendente o descendente; hasta que alcance una ubicación dentro del tubo en la que su densidad sea igual a la de su entorno; esta ubicación se denomina situación de flotabilidad neutra. Luego de centrifugar se producen una serie de bandas homogéneas, comenzando desde el fondo  las partículas con mayor densidad de flotación.

Con mucha frecuencia, se utiliza la ultracentrífuga durante la realización de estos gradientes.

El método de gradiente de densidades implica la utilización de un soporte fluido cuya densidad aumenta comenzando desde la zona superior a la inferior; por ello, en la centrifugación mediante un gradiente de densidad, se puede utilizar uno, o una mezcla de varios líquidos; con el fin de obtener varias bandas, o fracciones de diferentes densidades.

El método es un poco más elaborado que la centrifugación diferencial, no obstante presenta ventajas que compensan el trabajo añadido. Esta técnica permite la separación de varios o todos los componentes de la muestra; y la realización de medidas analíticas.

Los gradientes basados por ejemplo en el cloruro de cesio se autogeneran; es decir, se forman en el propio proceso de centrifugación; o  también puede ser preformados, como por ejemplo en el caso de la sacarosa o del percol.

Solutos utilizados al realizar la centrifugación mediante un gradiente de densidades

Como solutos se utilizan la sacarosa, polisacáridos sintéticos, derivados yodados del ácido benzoico, percol, cloruro de cesio, el Ficoll,o  sales de metales alcalinos pesados como el rubidio o el cesio, entre otros. La muestra se deposita en la parte superior del gradiente como una fina banda, o en otros casos se mezcla; y tras centrifugar, la separación de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas que pueden ser separadas (o fraccionadas).

Cuando elijas los solutos ten en cuenta que el material que utilices sea inerte o por lo menos; que no sea tóxico para el material biológico. Es por ello que las propiedades fisicoquímicas deben conocerse antes de decidir si se van a utilizar; y para para determinar la concentraciones adecuadas para el gradiente. Ten también presente que luego de la centrifugación, debe poder separar fácilmente la muestra del material, sin pérdida de la muestra o su actividad.

Hay dos variantes de este método: la centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica. Si deseas profundizar en uno de ellos, has click en el enlace que hay bajo el siguiente título.

Otros tipos o métodos de centrifugación

Haz clic en el método de centrifugación sobre el cual desees leer más.

 

Deseo comprar una centrífuga o sus accesorios

 

 

Quiero aprender sobre equipos que centrifugan… quiero ir a

Quiero volver a la página de inicio, volver a

 

Centrifugación zonal

Centrifugacion zonal

¿Qué es la centrifugación zonal?

La centrifugación zonal también llamada de centrifugación de velocidad de sedimentación; es un tipo de centrifugación por gradientes. Se diferencia de la isopícnica principalmente, en que la densidad máxima del gradiente, no puede exceder a la de las partículas a separar. Se centra principalmente en separar según la masa de las moléculas. Se diferencia de la centrifugación diferencial, en que esta última solo divide la muestra en dos partes, mientras que la zonal en varias partes.

El procedimiento es el siguiente: la muestra a analizar se deposita en la parte superior de una solución con un  gradiente de densidades previamente formado.

¿A qué se refiere con gradiente de densidades preformado en la centrifugación zonal?

Significa que previamente se han añadido sustancias  como por ejemplo ” sucrosa” diluida a diferentes concentraciones.  Con una jeringa se va añadiendo una por una cada dilución de sucrosa; arrancando con la de mayor concentración, y formando capas que serán atravesadas por los componentes a diferente velocidad,  según su masa, permitiendo la separación de partículas en la solución de estudio.

Existes tres tipos de gradientes de densidades preformados usados en la centrifugación por gradientes:

a) un gradiente discontinuo o escalonado, el cual se crea manualmente añadiendo lentamente al tubo solutos de diferentes densidades. Se utiliza en la centrifugación zonal.
b) un gradiente continuo, el cual se crea empleando un dispositivo formador de gradientes. Se utiliza en la centrifugación zonal y también en isopícnica.
c) un gradiente continuo autoformado, este se crea mediante centrifugación, normalmente a la vez que se fracciona la muestra. Este gradiente se utiliza con mayor frecuencia en la centrifugación isopícnica.

Posteriormente, se añade la muestra encima del gradiente preformado. A causa de la fuerza centrífuga las partículas de la muestra caen a través del medio separador a velocidades que dependen de la masa y sedimentan en diferentes zonas del gradiente; es decir, sedimentan a diferentes alturas respecto del tubo de  ensayo. La centrifugación zonal debe finalizar antes de que alguna de las partículas separadas llegue al fondo del tubo. Los componentes separados en cada zona homogénea, se recogen individualmente aspirando con mucho cuidado las diferentes bandas; también se puede realizar perforando el  tubo -este de naturaleza plástica-  y recogiendo en fracciones el líquido que cae.

Como consecuencia de lo anterior, si  la muestra se centrifuga por periodos más largos que lo establecido; todas las partículas se sedimentarán; esto ocurre porque el medio circundante a las partículas analizadas, es de más baja densidad que ellas. Es por ello que la centrifugación se debe finalizar antes de que las partículas lleguen al fondo del tubo; pues se podría generar sedimentación de 2 o más partículas.

Ventajas y desventajas de la centrifugación zonal

Una limitante de  esta técnica es que el volumen de la muestra a separar no debe ser mayor al 10% de la solución separadora; esto es con el objetivo de poder garantizar estabilidad y facilitar el proceso.

Adicionalmente, si se sobrepasa el tiempo de centrifugación, toda la muestra se vuelve a sedimentar en el fondo del tubo.

Otros tipos o métodos de centrifugación

Haz clic sobre el tipo de centrifugación sobre el que desees conocer más.

Deseo comprar una centrífuga o sus accesorios

 

 

Quiero aprender sobre equipos que centrifugan… quiero ir a

 

Quiero volver a la página de inicio, volver a

 

Centrifugación isopícnica

Centrifugacion isopícnica

¿Qué es la centrifugación isopícnica?

La centrifugación isopícnica; también conocida como centrifugación por gradiente de equilibrio, centrifugación de equilibrio en gradiente o centrifugación por gradiente isopínico; es un tipo de centrifugación muy utilizado en bioquímica para separar entidades basado en su punto isopícnico.

¿Que es el punto isopícnico?

Es el punto donde la densidad de la entidad o partícula se iguala a la densidad del líquido circundante.

 

Es decir, separa les partículas en un gradiente de densidades en función de la densidad de las mismas. Las partículas se mueven en el gradiente por un largo periodo de tiempo, hasta 1 o 2 días; hasta que llegan a un punto donde alcanza el equilibrio de sedimentación, entre la fuerza centrífuga, el empuje hidrostático de la célula y su difusión. En ese punto de equilibrio, la densidad de éstas y la del gradiente son idénticas (de aquí el nombre de ‘isopícnico’). En este caso, es condición fundamental que se utilice un gradiente continuo que cubra todo el intervalo de densidades de las partículas de la muestra; además, la densidad máxima del gradiente final ha de exceder siempre a la densidad de las partículas. Por este motivo, independientemente del tiempo de centrifugación, las partículas no se colapsarán nunca unas con otras en el fondo; así el tiempo de centrifugación sea infinito; pues las partículas flotan sobre una posición estable intermedia en el gradiente y tendrán mejor resolución; es decir, se concentrarán en una banda muy estrecha.

Esta técnica se utiliza, por ejemplo, para separar partículas similares en tamaño pero de diferente densidad. En este sentido, la centrifugación isopícnica es un método adecuado para separar ácidos nucleicos o  material de investigación viral.

Ten en cuenta que a diferencia de la centrifugación zonal, en la centrifugación isopícnica, la condición fundamental es que la densidad máxima del gradiente final siempre debe ser mayor a la densidad de las partículas.

Existes tres tipos de gradientes de densidades preformados usados en la centrifugación por gradientes:

a) gradiente discontinuo, el cual se crea añadiendo suavemente al tubo solutos de diferentes densidades. Utilizado principalmente en la centrifugación zonal.
b) gradiente continuo, este se crea empleando un dispositivo que forma los gradientes. Se utiliza en la centrifugación zonal y también en la centrifugación isopícnica.
c) gradiente continuo autoformado, creado usando la centrifugación, normalmente al tiempo que se fracciona la muestra. Utilizado con mayor frecuencia en la centrifugación isopícnica.

Ventajas y desventajas de la centrifugación isopícnica

Una vez centrifugada la muestra, no se producirá una sedimentación posterior; debido a que cada capa flota sobre una capa de material que posee una densidad superior a la propia. Esta técnica tiene mayor precisión y productividad para separar varias partículas de tamaño similar pero que difieren ligeramente en su densidad; y que son de difícil separación. Una aplicación tecnológica la constituye la aplicación de ingeniería genética para el diseño de medicamentos biológicos; y terapia celular, aplicando ultracentrifugación en lo que se conoce como diseño vectorial de virus adeno-asociados (adeno-associated virus (AAV) vector design); así como  plataformas de toxinas para la ablación  y terapia celular (AAV-toxin production platform for cell ablation research and therapy), especialmente utilizada para estudiar el comportamiento de tejidos, incluyendo los cancerosos; para estudiar como la información genética cambia de generación a generación en tumores.

Este método no es útil en el caso de las proteínas, ya que la mayoría de estas poseen la misma densidad.

Otra desventaja la constituyen los equipos y reactivos; elegir este método requiere una análisis costo versus beneficio; debido  al alto costo inicial y mantenimiento de los equipos e insumos.

Otros tipos o métodos de centrifugación

Haz clic sobre el tipo de centrifugación sobre el que desees profundizar.

Deseo comprar una centrífuga o sus accesorios

 

 

Quiero aprender sobre equipos que centrifugan… quiero ir a

 

Quiero volver a la página de inicio, volver a

 

Centrifugación diferencial o pelleting

Centrifugación diferencial o pelleting

¿Que es la centrifugación diferencial o pelleting?

La centrifugación diferencial, también llamada de frontera móvil; es el método más común utilizado hoy en día para fraccionar las células. Fraccionar las células es su separación en los diferentes organelos, para un análisis posterior de sus partes.

Alistamiento

  1. Se corta el tejido en presencia de un amortiguador isotónico helado. ¿Por qué?
    1. El frío  detiene las reacciones de la enzima.
    2. Debe ser isotónico para  evitar rompimientos bruscos en la célula por difusión osmótica.
    3. Un amortiguador para detener los cambios de PH.
  2. Se muele el tejido en una licuadora para romper las células abiertas.
  3. Se filtra para eliminar el tejido insoluble.

Centrifugado

En el proceso, una muestra de tejido se lisa primero para romper, de manera controlada, las membranas celulares y mezclar el contenido de la célula.

Lisis celular

La lisis celular es el proceso de ruptura de la membrana celular que produce la salida del material intracelular;  puede ser provocado ya sea  por enzimas o  por diferencias de conc entración  entre el exterior e interior a la membrana celular. Estas última puede causar ingresos bruscos del agua -difusión osmótica hypotónica- que produce hinchamiento de la célula hasta hacerlas explotar, lo cual puede compromer inclusive a los organelos.

En el caso del lisado controlado, lo que hacemos es someter las células a una secuencia de centrifugaciones; en cada una se incrementan secuencialmente las revoluciones, para conseguir mayores fuerzas de sedimentación; luego de cada operación se obtiene una separación en dos fases: la más pesada se va al fondo, y se denominada sedimento o Pellet; la más liviana, la cual queda en la parte superior del tubo, se denominada sobrenadante.

Pellet

Pellet es una palabra inglesa que también es  utilizada como verbo para indicar la acción de separar componentes  sedimentándolos.

Algunas veces el pellet es un solo elemento, pero en general es una mezcla de todos los componentes sedimentados. Ten en cuenta que el sedimento suele estar levemente contaminado con partículas sobrenadantes que pueden haber quedado atrapadas en el fondo del tubo. Una vez finalizada la centrifugación, el líquido sobrenadante se vierte con mucho cuidado en otro tubo; con lo cual se obtiene la separación entre el líquido y el sólido  pellet; esta operación, se llama decantación y es la más elemental de las técnicas de separación.

Según el caso, pueda que sea necesario repetir la centrifugación varias veces, cada vez a una mayor velocidad; a este proceso se le denomina recentrifugar. Según la necesidad del estudio, pueda que se requiera volver a centrifugar tanto  el sobrenadante como  el pellet, para obtener una mayor purificación.

¿Cómo se lisa la sangre?

En el caso de la sangre, se centrifuga el filtrado así:

Centrifugacion diferencial - sangre

Etapa 1: 1.000 x g durante 10 minutos. El sedimento obtenido es el núcleo, que es el orgánulo más denso.

Etapa 2: 10.000 x g durante 30 minutos. Sedimenta la mitocóndria que es el segundo orgánulo más denso.

Etapa 3: 100.000 x g durante 30 minutos. Sedimenta ER, el aparato de golgi y otros fragmentos de membrana.

Etapa 4: 300.000 x g durante 3 horas. Sedimenta ribosomas.

 

Finalmente, la purificación se puede realizar a través de la sedimentación de equilibrio, y la capa deseada se extrae para un análisis posterior.

Ventajas y desventajas de la centrifugación diferencial

La centrifugación diferencial se basa en una diferencia en la velocidad de sedimentación de las moléculas; es por ello que hay que tener en cuenta que la diferencia debe ser grande para poder ser observada al centrifugar, pues cuando hay partículas muy similares, tienden a sedimentar juntas. Este método es utilizado como centrifugación preparativa para separar partículas de otros componentes en la mezcla; no es útil para separar moléculas sobre todo entidades orgánicas que pueden poseer una densidad muy parecida.

Otros tipos o métodos de centrifugación

 

Deseo comprar una centrífuga o sus accesorios

 

Quiero aprender sobre equipos que centrifugan… quiero ir a

Quiero volver a la página de inicio, volver a